[논문자료] 이매패류에 오염된 노로바이러스의 검출법 정립과 불활성화 연구

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이매패류에 오염된 노로바이러스의 검출법 정립과 불활성화 연구

Norovirus Detection and Inactivation in Bivalve Molluscan Shellfish

 

최근 국내외 연구기관에서 수행해 온 굴 등에서의 노로바이러스 분석 방법을 비교하여 이매패류에서 노로바이러스 검출기법 정립과 표준화를 시도하고, 정립된 노로바이러스 검출법을 현장시료에 적용하여 우리나라 연안의 패류생산해역에서 노로바이러스의 오염실태를 파악함으로써 식품위생안전 대책을 수립하기 위한 자료를 확보하고자 하였다.

그리고 대체바이러스인 FCV를 이용하여 패류와 해수 중 노로바이러스 불활성화 조건을 구명하고자 초고압 처리기술과 전기분해수 및 광촉매 자외선 처리에 의한 노로바이러스 불활성화 효과를 구명하고자 하였다.

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이매패류 중 노로바이러스 최적 검출법을 정립하기 위해 바이러스 농축법과 핵산 추출법을 교차 적용한 결과, Glycine 처리를 통한 1차 용출과 Threonine 처리를 통한 2차 용출 후 Vertrel XF의 세정과정과 2차 PEG 침전을 통해 PCR 방해물질을 효과적으로 제거할 수 있는 Protocol C가 타 방법에 비해 우수하였으며 QiaAmp Viral RNA Mini Kit를 사용하는 핵산 추출법이 Trizol 추출법보다 더 나은 효율을 가지고 있음을 알 수 있었고 QiaShredder를 사용하는 것이 더욱 명확한 결과를 얻는데 효과적인 것으로 판단된다.

한편, RT-Nested PCR에 사용되는 Primer의 민감도 및 적합성을 고찰한 결과, 노로바이러스 GI의 경우는 G2F1M/G2-F3/G2R1M Primer Set가 그리고 GII의 경우는G2F1M/G2-F3/ G2R1M과 NV2oF2/NV2oR/G2-F3/G2SKR Primer Set가 우수한 것으로 판단되었다.

2007년 2월부터 11월까지 우리나라 연안 15개소에서 채집된 총 140개의 시료를 대상으로 노로바이러스 오염실태를 조사한 결과, 31개의 시료에서 노로바이러스 유전형 GI 또는 GII가 검출되어 22.1%의 검출율을 나타내었다. 계절적 차이는 발견할 수 없었으며 패종별 검출율 역시 계절 변화와 유의할 만한 상관관계를 찾을 수 없었다.

지역에 따른 검출율은 지역적 차이보다는 시료별 검출율 차이에 기인한 것으로 사료되었다.

검출된 GII형은 모두 Genotype 4로 환자의 분변에 의한 생태계 오염과 패류와 같은 수산식품을 매개로한 재감염이 발생하고 있는 것으로 추정되었다.

패류생산해역 해수 중 노로바이러스 오염범위 조사를 위해 충남 천수만을 대상으로 2007년 2월부터 10월까지 해수 중 노로바이러스 농도 변화를 주요 오염원을 중심으로 조사한 결과, 노로바이러스는 계절에 따라 급격한 농도 변화를 보이며 해수의 수심에 따른 농도 변화는 크지 않은 것으로 사료되었다.

조사지점에 따라 노로바이러스가 점 오염원과 비점 오염원으로부터 동시에 유입되는 것으로 확인되었다.

조사결과 해수의 물리화학적 및 세균학적 수질과 노로바이러스 검출 농도와 어떠한 상관관계도 보이지 않았다.

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노로바이러스를 제어할 수 있는 고압처리 조건과 압력처리 조건에 따른 조직변화와 관능적 품질변화를 조사한 결과, FCV는 50,000 Psi에서 60초(25℃)의 압력처리로 6.8 Log·TCID50·ML^(-1)의 감소를 보여 실험에 사용된 모든 바이러스가 감염력을 상실한 것으로 나타났다.

5,000 Psi와 20,000 Psi 압력 처리에 따른 굴의 조직학적 변화를 대조구와 비교할 때 대조구와 처리구(5,000 Psi 이상) 사이의 정성적인 조직학적 변화와 색차 변화의 양상이 뚜렷하였다.

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전기분해수의 경우에는 처리 10분 후에는 측정한계치인 1.8 Log·TCID50·ML^(-1)으로 감염력을 대부분 상실한 것으로 나타났으며, 광촉매 자외선 살균장치를 이용하여 FCV의 세포감염력을 검토한 결과, 처리 30초 이후부터 감염가가 떨어지기 시작하여 3분 후에는 FCV가 불활성화 되었다.

사용된 광촉매 자외선 살균 처리기술은 OH- 라디칼의 산화력과 자외선의 살균력을 복합적으로 이용한 것으로 자외선 조사 단독으로 바이러스를 불활성화시키는 처리법에 비해 효과가 큰 것으로 나타났다.

 

 

While the fecal coliform is universally accepted as the criterion for the bacteriological water quality of shellfish harvesting waters, the scientific consensus is that these indicators do not reflect the occurrence of norovirus in the marine environment. Because of the absence of effective indicator systems, scientists have attempted the direct detection of viruses from shellfish and their harvesting waters. These virus concentration and detection steps are limited by the need for large sample sizes to detect the low virus levels. Therefore, it is necessary to investigate the efficient method for the concentration of human noroviruses and standardize the detection of human norovirus in bivalve shellfish.

When shellfish was contaminated with virus, there are limited post-harvest options for inactivating infectious virus within shellfish while retaining the raw characteristics and high market value of the product. Therefore, in this study, the concentration and detection method was evaluated for monitoring human norovirus in shellfish and the contamination status in shellfish and seawater in the Korean coastal area was investigated. And also the effect of high pressure, photocatalyst UV irradiation and electrolyzed seawater on inactivation of norovirus using feline calicivirus as surrogate of norovirus was evaluated. The results of this study were as followed.

One of the concentration methods, including viral elution by glycine and threonine buffer, concentration by Vertrel XF, primary and secondary PEG precipitation, were more efficient than other concentration methods. Viral RNA was more efficiently extracted by Viral RNA Mini Kit than Trizol extraction. In addition, a clear bands were shown in a gel when QiaShredder Homogenization step was added. In genogroup 1, G1F1M/G1-F2/G1R1M primer set were more sensitive and specific than other primer sets for the detection of genogroup 1 in PCR amplification. In genogroup 2, G2F1M/G2-F3/G2R1M and NV2oF2/NV2oR/ G2-F3/G2SKR primer sets were more sensitive and specific than other primer sets in PCR amplification.

From February to November 2007, 140 shellfish samples were collected and were monitored for the noroviral contamination by RT-nested PCR. Norovirus-positive samples were detected in the samples collected during whole survey period. Overall detection rate was 22.1% and 71% of detected norovirus was classified into genogroup 2 (II). By sequence analysis, the norovirus-positive samples, which were grouped with genotype 4 of norovirus genogroup 2 (GII/4), were closely related to strains recognized as a worldwide epidemic outbreak.

The contamination range of norovirus in shellfish growing area from pollution sources was investigated in Cheonsuman and high level norovirus was detected at the station closed to point pollution sources and non-point pollution was also observed.

Norovirus surrogate (feline calicivirus, FCV) was inactivated by treatment at 50,000 psi for 60 sec by 6.8 log·TCID50·mL^(-1). Tissue of oyster (digestive gland, gill and mantle) was qualitatively destroyed and distorted by treatment over 5,000 psi for 60 sec. High pressure treatment induced progressive changes in proximal composition of oyster and color of oyster adductor muscle. High pressure treatment effectively reduced norovirus surrogate but induced conformational changes in tissue and color of oyster flesh. Electrolyzed seawater and photocatalyst UV also effectively inactivated FCV. FCV was totally inactivated after 10 minutes exposure to electrolyzed seawater and 3 minutes irradiation of photocatalyst UV.

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출처 : http://www.riss.kr/search/detail/DetailView.do?p_mat_type=be54d9b8bc7cdb09&control_no=77b9e47c06ef5533ffe0bdc3ef48d419

 

 

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